小鼠原代視網(wǎng)膜色素上皮細胞注意事項：

1.收到細胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

2.收到細胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時（視細胞密度而定）穩(wěn)定細胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議收細胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細胞在運輸過程中是否有污染情況。作為我方進行銷售依據(jù)。

3.由于細胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊懀时竟局槐ＷC客戶收到細胞后一周內(nèi)的細胞狀態(tài)，故客戶需要售后時需出示收到細胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發(fā)現(xiàn)問題后客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大于7天。

4.所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。續(xù)寫內(nèi)容：

5. 細胞傳代時，建議使用預溫的PBS輕柔洗滌2-3次，以徹底去除殘留的培養(yǎng)基和血清成分，避免消化酶活性受影響。消化時間需嚴格控制，通常以0.25%胰酶（含EDTA）在37℃下作用1-2分鐘為宜，鏡下觀察到細胞間隙增大、邊緣收縮即可終止消化。過度消化可能導致細胞膜損傷，影響后續(xù)貼壁和增殖。

6. 原代視網(wǎng)膜色素上皮細胞（RPE）對培養(yǎng)基成分敏感，建議使用專用培養(yǎng)基（如DMEM/F12添加10%胎牛血清、1%非必需氨基酸及2mM L-谷氨酰胺），并每2-3天更換一次。若細胞出現(xiàn)生長遲緩或形態(tài)扁平化，可嘗試添加5ng/mL bFGF以促進活力。換液時需保留1/3原培養(yǎng)基，避免環(huán)境驟變導致細胞應激。

7. 凍存復蘇需注意梯度降溫：4℃ 30分鐘→-20℃ 2小時→-80℃過夜→液氮長期保存。復蘇時需快速解凍，37℃水浴中輕搖至冰晶消失，立即轉(zhuǎn)移至含10倍體積培養(yǎng)基的離心管中，低速離心后棄上清，重懸接種至預鋪膠原蛋白的培養(yǎng)皿（密度建議5×10?/cm2）。前24小時避免頻繁觀察，減少擾動。

8. 功能性實驗（如吞噬實驗、屏障功能檢測）建議在細胞傳代后第3-5代進行，此時細胞形態(tài)穩(wěn)定且功能成熟。若需誘導極化，可采用Transwell小室培養(yǎng)21天，定期檢測跨膜電阻（TEER）值至穩(wěn)定＞200Ω·cm2。操作時注意氣液界面濕度控制，避免邊緣效應影響數(shù)據(jù)準確性。

9. 定期進行STR鑒定和支原體檢測，尤其長期培養(yǎng)時需每2個月驗證一次。若發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)異常空泡化或顆粒增多，可嘗試添加1%雙抗處理48小時，并排查培養(yǎng)箱CO?濃度（保持5%）及濕度（95%）是否達標。建議建立不同批次的工作細胞庫，避免實驗中斷風險。