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CHO 殘留 DNA 檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)試劑盒簡介：

CHO 殘留DNA 檢測試劑盒是用于定量檢測各種生物制品及藥品的中間品、半成品和成 品中殘留的 CHO  宿主細胞 DNA。
本試劑盒利用 Taqman 探針法， 定量檢測樣本中 CHO  殘留 DNA。該方法具有速度快、 特異性高、  性能可靠且 檢測限可達到 fg 級別。
試劑盒組份：

表 1：試劑盒組份

試劑 裝量 貯存條件
CHO control DNA 40ul×1 管 -20oC
DNA dilution buffer 6ml ×1 瓶 -20oC
2×Taqman master mix (+UNG/ROX) 0.75ml ×2 管 -20oC
10×CHO qPCR mix 0.3ml ×1 管 -20oC
RNase-Free H2O 1.5ml×1 管 -20oC
規(guī)格 ：100  反應
適用機型：
PRISM 7500 Real-Time PCR System (ABI)
StepOne Plus Real-Time PCR System (ABI)
LightCycler 480 (Roche)
AriaMX (Agilent Technologies)
CFX (BIO-RAD)

實驗所需但試劑盒未包含材料：

? 1.5ml 無菌低吸附離心管
? 96 孔 qPCR  板
? 一次性手套
? 1000ul 、100ul 、10ul 無菌低吸附帶濾芯移液槍頭

實驗操作過程：

一、 CHO DNA 定量參考品的稀釋及標準曲線的制備

用試劑盒中提供的 DNA dilution buffer 將 CHO control DNA 進行梯度稀釋， 稀釋濃度依 次為 300pg/ul 、30pg/ul 、3pg/ul 、300fg/ul 、30fg/ul 、3fg/ul 。具體操作如下：

1.將試劑盒中的 CHO control DNA 和 DNA dilution buffer 置于冰上融化，待完全融化后，

輕微振蕩混勻，簡短快速離心。

2.取 6 支干凈的 1.5ml 離心管，分別標記為 SD1 ，SD2 ，SD3 ，SD4 ，SD5, SD6。

3，SD1 管中加入 198ul DNA dilution buffer，其余管中分別加入 180ul DNA dilution buffer。

4,取 2ul  CHO  control  DNA 加入 SD1 管中， 然后渦旋振蕩混勻 5- 10s 后短時快速離心 5s，渦旋振蕩和快速離心各重復 3 次。

5,按表 2 依次進行 6 次梯度稀釋操作，稀釋操作同步驟 4。

表 2. CHO control DNA 的稀釋

稀釋管	稀釋體積	濃度
SD1	2ul CHO control DNA+198ul DNA dilution buffer	300 pg/ul
SD2	20ul SD1+180ul DNA dilution buffer	30 pg/ul
SD3	20ul SD2+180ul DNA dilution buffer	3 pg/ul
SD4	20ul SD3+180ul DNA dilution buffer	300 fg/ul
SD5	20ul SD4+180ul DNA dilution buffer	30 fg/ul
SD6	20ul SD5+180ul DNA dilution buffer	3 fg/ul

二、加樣回收質(zhì)控 ERC 的制備

根據(jù)待測樣本的殘留量設置 ERC 中 CHO  control  DNA 的加樣濃度 (以制備加 45pg  CHO control DNA 的樣本 ERC 為例)，操作如下：

1，取待測樣本 100u，加至 1.5ml 干凈的離心管中；

2，加入 1.5ul SD2，混勻，標記為樣本 ERC。

注：樣本 ERC 和同批待測樣本需一起進行樣本前處理。

三、陰性質(zhì)控 NEG 的制備

根據(jù)實驗設置陰性質(zhì)控，操作如下：

1，取 100ul 樣本基質(zhì)溶液(或洗脫液)加至 1.5ml 干凈的離心管中標記為陰性質(zhì)控 NEG。 注：陰性質(zhì)控 NEG 樣本和同批待測樣本需一起進行樣本前處理。

四、 qPCR 反應液的制備和加樣

1，根據(jù)所要檢測的標準曲線及待測樣本數(shù)量，計算所需反應孔數(shù)，一般做 3 個重復孔/樣。

反應孔數(shù)=  (6 個濃度梯度+1 個無模板對照 NTC+1 個陰性質(zhì)控 NEG+待測樣本×2) ×3 注：待測樣本×2 是為了讓每個待測樣本檢測時都同時做樣本 ERC 。                  2，根據(jù)反應孔數(shù)計算本次實驗所需的各組分的所需總量以制備 pre-mix：

2×Taqman master mix=(反應孔數(shù)+2) ×15ul    (含有 2 孔的損失量)

10×CHO qPCR mix=  (反應孔數(shù)+2) ×3ul

RNase-free H2O=  (反應孔數(shù)+2) ×2ul

3，各試劑置于冰上融化，振蕩混勻，按表 3 所示進行加樣：

表 3.各反應孔加樣示例

標準曲線	20ul pre-mix+ 10ul SD1/SD2/SD3/SD4/SD5/SD6
NTC	20ul pre-mix+ 10ul DNA dilution buffer
NEG	20ul pre-mix+ 10ul NEG
待測樣本	20ul pre-mix+ 10ul 待測樣本
ERC 樣本	20ul pre-mix+ 10ul ERC 樣本

注：加樣完成后每孔總體積為 30ul。